Departamento de Genética e Evolução

ID: 9408

Resumo

A enzima β-glicosidase é uma celulase, que atua em sinergia com outras enzimas do complexo celulolítico, convertendo a celobiose em moléculas de glicose. Foi identificada recentemente por nosso grupo de pesquisa no transcriptoma de cupins da espécie Heterotermes tenuis, o que torna esses insetos importantes alvos de bioprospecção enzimática.

Clonagem, expressão heteróloga e caracterização da enzima β-glicosidase presente em cupins da espécie Heterotermes tenuis, visando sua aplicação na produção de etanol de segunda geração.

3.1. Análises in silico

As análises foram realizadas por meio de ferramentas on-line de bioinformática, a partir da sequência de aminoácidos em formato FASTA. Os softwares utilizados nas predições foram UCL-CS Bioinformatics, Phyre2 e YinOYang 1.2.

3.2. Extração de RNA dos cupins e transformação em cDNA

Os cupins foram pulverizados em nitrogênio líquido e o RNA foi extraído com o reagente Trizol® (Invitrogen), 100 ng de RNA de cada amostra foram utilizados para a síntese de cDNA, com uso de SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher). Os protocolos seguiram as instruções do fabricante.

3.3. Amplificação da sequência

Baseado na sequência do transcriptoma, iniciadores foram desenhados visando a amplificação da sequência codificante, obtida utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/L) (Thermo Fisher), seguindo as instruções do fabricante. A verificação da amplificação foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1%.

4.1. Análises in silico

As análises in silico mostraram que a proteína possui uma estrutura formada em sua maioria por alfa hélices e folhas beta, com maioria de regiões hidrofóbicas e com uma porção de interação com a membrana celular. Adicionalmente, para seu correto dobramento, essa proteína apresenta uma alta taxa de glicosilação, sugerindo que a expressão em organismos eucariotos poderia ser a melhor escolha para se obter a proteína solúvel e funcional.

4.2. Síntese de cDNA e amplificação da região codificante da enzima β-glicosidase

A integridade do RNA extraído foi verificada por eletroforese em gel desnaturante de agarose, que evidenciou o aparecimento dos fragmentos das subunidades ribossomais. Adicionalmente à correta síntese de cDNA, foi realizada uma amplificação de um fragmento do gene codificante para a proteína β-actina, uma vez que este é um gene de expressão constitutiva nesse inseto. Após a comprovação da eficiência da síntese, os iniciadores desenhados com base no transcriptoma foram utilizados em uma reação em cadeia da polimerase (PCR), para a amplificação da região codificante do gene da enzima β-glicosidase. Após a eletroforese, foi constatada a amplificação do fragmento do tamanho esperado (1488 pb). Este fragmento encontra-se em fase de clonagem no vetor PpicZa, para expressão heteróloga na levedura Picchia pastoris. Em seguida, experimentos de caracterização da atividade enzimática serão realizados, visando a comparação com outras enzimas já descritas na literatura.

A caracterização in silico da enzima possibilitou o conhecimento de sua possível estrutura tridimensional e modificações pós-traducionais. Com a obtenção da região codificante da proteína, espera-se, dando continuidade aos experimentos, obter uma proteína solúvel e funcional, expressa em um organismo eucarioto, a qual poderá ser utilizada para fins biotecnológicos.

Apresentação

ID: 9405

Resumo

INTRODUÇÃO: Lacases são glicoproteínas monoméricas presentes no grupo das multicobre oxidases, sendo assim classificadas por apresentarem habilidade oxidativa em decorrência dos seus centros de cobre. Tais enzimas são responsáveis pela oxidação de uma gama variada de substratos, e, além disso, estão envolvidas na melanização da cutícula de insetos. Vale salientar seu uso na etapa de pré-tratamento da biomassa na produção industrial do etanol de segunda geração, em decorrência de sua capacidade em degradar a estrutura rígida da lignina. Os cupins são insetos eusociais que possuem alta capacidade de degradar biomassa, tornando-se alvos potenciais para bioprospecção desta enzima para aplicação industrial. Estudos realizados pelo nosso grupo analisando o transcriptoma de espécies de cupins brasileiros identificou alta expressão de novas possíveis lacases. A espécie escolhida para este trabalho foi Heterotermes tenuis, uma praga da cana-de-açúcar (matéria-prima da produção de etanol), ademais, tal espécie possui forrageio noturno, o que indica a possível produção de enzimas com características divergentes das já conhecidas. OBJETIVOS: Amplificar a região codificadora, clonar e expressar a enzima em sistemas heterólogos eucarióticos – levedura Pichia pastoris -, buscando analisar sua atividade enzimática para uma possível aplicação industrial. MATERIAL E METÓDOS: O RNA total de H. tenuis foi extraído e o RNAm convertido a cDNA com uso da SuperscriptIII (Invitrogen). Os iniciadores foram desenhados usando a sequência identificada na análise do transcriptoma desta espécie. As análises in silico da proteína para predição de estrutura e glicosilação foram realizadas utilizando ferramentas de bioinformática. DISCUSSÃO E RESULTADOS: Infelizmente, mesmo após variados testes e alterações de protocolo, não foi possível obter a amplificação da sequência codificante da lacase. Uma possível explicação seja que a sequência encontrada no transcriptoma seja proveniente de simbiontes e que, por isso, a quantidade de RNAm presente no RNA total extraído não tenha sido suficiente para sua amplificação. No entanto, com a sequência de nucleotídeos obtida, fizemos avaliações in silico que nos sugeriram que a enzima resultante apresenta um alto grau de glicosilação e, também, alterações em seu sítio catalítico, diferenciando-a de outras lacases já descritas na literatura. Essa sequência será enviada para síntese no vetor de expressão pPICZαA para expressão na levedura Pichia pastoris. Experimentos visando à amplificação de uma xilanase, que também apresenta importância na produção de etanol de segunda geração por catalisar a clivagem das ligações β-1,4 da cadeia principal da xilana, principal constituinte da hemicelulose, estão também sendo conduzidos com resultados muito promissores. CONCLUSÃO: Apesar de não obtermos sucesso na amplificação da enzima proposta, nossos resultados in silico evidenciaram o potencial de aplicação da enzima identificada e sua diferença de outras lacases já descritas. Por isso, acreditamos que com sua síntese química baseada na sequência identificada no transcriptoma dessa espécie de cupim possamos obter uma enzima capaz de aprimorar o processo de produção de etanol de segunda geração. Isto, a fim de melhorar o rendimento e reduzir os custos de produção deste importante biocombustível.

Apresentação

ID: 9528

Resumo

Infecções pelos vírus da dengue e zika são muito frequentes em países tropicais e subtropicais¹. Só no Brasil, foram registrados 931.903 casos de dengue e 6.705 casos de zika entre dezembro de 2019 e setembro de 2020². Ambas viroses apresentam sintomas muito semelhantes, como dores de cabeça, nas articulações e febre, o que dificulta o diagnóstico diferencial baseado apenas no quadro clínico³. Atualmente, são utilizadas técnicas como RT-PCR e ELISA para auxiliar na detecção da doença, mas estas são demoradas, complexas e de alto custo, dificultando o diagnóstico⁴. Os biossensores são plataformas que permitem detecção rápida, simples e de baixo custo, trazendo uma nova perspectiva para auxiliar nessa problemática⁵. Frente a isso, o presente projeto tem como objetivo desenvolver biossensores elétricos descartáveis capazes de detectar as proteínas NS1 dos vírus da dengue e da zika. Eletrodos de ouro interdigitados foram funcionalizados com anticorpos contra a proteína alvo pelo método de montagem de monocamadas automontadas (SAM), a qual foi construída com MPA (ácido 3-mercaptopropiônico), EDC (carbodiimida) e NHS (N-hidroxisuccinimida), permitindo com que o anticorpo fosse imobilizado na superfície do eletrodo. As etapas de modificação foram monitoradas por medidas de capacitância elétrica em Solartron 1260 na faixa 10² a 10⁶ Hz e os resultados foram analisados pelo método de componentes principais (PCA). Para isso, foram construídas duas unidades sensoriais, sendo elas eletrodo com filme orgânico (FO) e eletrodo com filme orgânico e anticorpo (AC), a fim de investigar se as alterações observadas eram advindas da interação antígeno-anticorpo. As análises por PCA foram realizadas para a frequência de 10⁵ Hz, uma vez que nesta houve maior reprodutibilidade e melhor discriminação das amostras. Os resultados indicam que ambos imunossensores da Dengue e da Zika foram capazes de discriminar as amostras com 100% de acerto, considerando PC1 e PC2, sendo a unidade sensorial AC a mais influente na discriminação. Assim, fica evidente a seletividade de ambos sensores e sua capacidade de diferenciação, sendo estes uma alternativa promissora para o diagnóstico rápido, simples e diferencial entre Dengue e Zika.

Apresentação

ID: 9435

Resumo

O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria do gênero Xanthomonas e, por não possuir cura ou medidas de controle eficazes, acarreta em grandes prejuízos para a citricultura brasileira. Em uma análise proteômica de superfície realizada anteriormente em nosso grupo de pesquisa em Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) foi identificada a chaperona DnaK em maior quantidade em condições infectantes (interação com a planta, in vivo) do que em condições não infectantes (meio CN não indutor de patogenicidade, in vitro). A DnaK já foi relatada como estando em superfícies celulares de outras espécies bacterianas patogênicas. Previamente a DnaK de Xac foi expressa em nosso grupo na forma heteróloga e purificada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos, os quais foram aqui utilizados. O objetivo deste trabalho foi comprovar a localização superficial da DnaK em Xac e sua possível relação com a patogenicidade. Para isto foram realizados experimentos de Western Blot em células cultivadas em meio CN ou in vivo (folhas de limão-galego), além de ensaios de formação de biofilme, microscopia confocal de fluorescência e ELISA, nos quais as células foram crescidas em CN ou XAM-M (meio indutor de patogenicidade). Para o Western Blot, as células de Xac foram colocadas em contato com anticorpos anti-DnaK e os anticorpos residuais não ligados à superfície celular foram detectados por Western Blot contra a proteína DnaK recombinante produzida neste trabalho a partir de clone disponível (gene da DnaK de Xac clonado em vetor pET). Os resultados não foram satisfatórios apesar de se ter notado sutil diferença da quantidade de anticorpos em relação ao controle (concentração de anticorpos antes de ser colocado em contato com as células). O ensaio de biofilme foi feito em microplaca com as células na presença de diluições decrescentes dos anticorpos anti-DnaK sendo o biofilme medido em 24, 48 e 72 horas após coloração com cristal violeta e medida da D.O. a 595 nm. O resultado mostrou que a DnaK deve estar na superfície de Xac e envolvida na formação de biofilme uma vez que o aumento de anticorpos anti-DnaK interferiu de maneira crescente na sua formação. A microscopia confocal de fluorescência foi realizada para identificação visual diferencial de DnaK superficial em Xac, adicionando-se anticorpos anti-DnaK e anticorpos secundários anti-IgG de coelho conjugados com fluorescein isothiocyanate (FITC). Os resultados mostraram diferença significativa de DnaK superficial entre as condições testadas. Para realização do ELISA, assim como o Western Blot, os anticorpos anti-DnaK residuais do contato com as células, diluídos 1:100, 1:1000 e 1:10000, foram quantificados por reação em placa com a DnaK recombinante imobilizada.  O ensaio de ELISA não foi sensível quanto o esperado ou não houve diferença significativa entre as condições. Acredita-se que as condições do teste de ELISA e do Western Blot possam ainda ser otimizados, o que não foi possível devido ao isolamento ocasionado pela Pandemia do COVID-19. Já os resultados da microscopia e do ensaio de biofilme indicam tanto a presença de DnaK na superfície celular como também diferenças na sua abundância na célula infecciosa relativamente à célula não infecciosa. Posterior ensaio será realizado de citometria de fluxo para comprovar esses resultados. Em conclusão, os resultados apontam para a presença da chaperona DnaK na superfície de Xac  e também para o seu  envolvimento com a formação de biofilme, aspecto este relacionado com a sua patogenicidade.

Agradecimentos: À FAPESP (Proc. 07/50910-2) – Proj. Jovem Pesquisador, ao IFSC – USP São Carlos pela utilização do microscópio confocal - Projeto FAPESP 2009/54035-4, ao grupo do Laboratório de Bioquímica Funcional e Estrutural (LBFE/DQ/UFSCar) da profa. Dra. Dulce Helena Ferreira de Souza, ao grupo do laboratório de Inflamação e Doenças Infecciosas (LIDI/DMP/UFScar) da profa. Dra. Fernanda de Freitas Anibal.

Apresentação

ID: 9133

Resumo

O DNA mitocondrial (mtDNA) está sujeito a mutações que podem desencadear doenças graves. Estas mutações tendem a se acumular no fígado, processo que provavelmente depende da dinâmica mitocondrial. Ciclos contínuos de fissão e fusão mitocondrial levam a segregação de mtDNAs entre as organelas. Neste contexto, foi realizado o nocaute fígado-específico do gene Mfn2 (Mitofusina 2), um gene essencial para a fusão mitocondrial, com objetivo de avaliar seu impacto sobre o acúmulo de mtDNA mutante em camundongos. O nocaute foi realizado através do sistema Alb-cre-loxP, resultando em dois grupos: controle-selvagem (WT) e Mfn2-nocaute (KO). Foram utilizados animais heteroplásmicos para dois haplótipos mitocondriais de origem NZB/BINJ e C57BL/6N, os quais foram avaliados quanto a segregação no fígado. Conforme descrito na literatura, o acúmulo do haplótipo NZB/BINJ resulta em disfunção mitocondrial e é bastante empregado no estudo da herança mitocondrial. Dessa forma, foram realizadas coletas de tecidos (cauda e fígado) dos grupos WT (n = 12 animais) e KO (n = 15 animais), de animais com 100 dias. O modelo experimental foi validado a partir de análise por PCR quantitativo (qPCR), a qual indicou que a expressão do gene Mfn2 estava diminuída em 9,8 vezes nos animais KO em comparação ao WT. Também foi utilizado qPCR para determinação dos níveis de mtDNA NZB/BINJ. Ambos os grupos não apresentaram diferença estatística para o nível de NZB/BINJ nem na cauda (P = 0,70), WT (19,3% ± 3,29) e KO (17,7% ± 2,57), nem no fígado (P = 0,77), WT (36,6% ± 5,18) e KO (34,7% ± 3,91). Além disso, não houve diferença quanto ao número total de cópias de mtDNA no fígado, entre os grupos (P = 0,61): animais WT apresentaram 5.035 ± 610, enquanto os KO apresentaram 5065 ± 389. Os níveis de mtDNA NZB/BINJ no fígado dependem dos níveis iniciais desse haplótipo no animal, e por isso, os níveis na cauda foram utilizados como um fator de normalização, já que esse tecido apresenta segregação neutra; a normalização foi expressa através do cálculo do ΔNZB. Novamente, os resultados não diferiram entre os grupos (P = 0,93): o ΔNZB foi igual a 17,3% em animais WT e 17,0% em animais KO. Portanto, houve um aumento de ~17% nos níveis de mtDNA NZB/BINJ no fígado comparado aos níveis iniciais (com base em estimativa a partir da cauda), e este aumento foi independente da expressão de Mfn2. Foi realizada uma segunda correção dos valores de mtDNA NZB no fígado, o ΔNZB transformado. Esse dado trata-se de uma normalização mais robusta que também se baseia no nível de cada haplótipo na cauda. Como resultado, também não observamos diferença entre os grupos experimentais (P = 0,96). Como conclusão, os resultados indicam que a ablação de Mfn2 não interfere na seleção positiva de mtDNA NZB no fígado, já que o acúmulo continua acontecendo mesmo na ausência deste gene.

Apresentação

ID: 9297

Resumo

O enriquecimento ambiental (EA) refere-se à introdução de diferentes estímulos utilizados para melhorar as condições de vida de animais mantidos em ambientes limitados. EA pode impactar no bem-estar animal, diminuindo o estresse, ansiedade e indícios de depressão, e melhorando a qualidade de vida devido às alterações sensoriais ocasionadas por esse ambiente enriquecido. Ele pode ser oferecido em diferentes fases de vida do animal e impactar alterações comportamentais que poderão repercutir em alterações na expressão de vários genes, isto é, alterações epigenéticas. O presente trabalho investigou o efeito do EA em fêmeas murinas púberes da linhagem LG/J, em sua emocionalidade e cuidado materno. Entre os objetivos elencados pretendíamos verificar o efeito do EA na metilação de genes candidatos expressos no hipotálamo dessas fêmeas. Para tanto, dois grupos foram compostos, um grupo experimental (GE; n=20) com exposição ao EA na fase púbere, e um grupo controle (GC; n=20) sem exposição ao EA. Para todas as fêmeas foi monitorada a emocionalidade por meio dos testes de Campo Aberto (CA), Labirinto em Cruz Elevado (LCE) e Nado Forçado (NF), na fase púbere, adulta, materna e pós desmame. Ao atingir a maturidade, as fêmeas foram encaminhadas para reprodução e o cuidado materno foi investigado nas mães dos dois grupos. Foi realizada a busca de genes candidatos na literatura, em que, para investigar o padrão de metilação entre os grupos, foi escolhida a técnica Methylation-Specific PCR (MSP). Quanto a emocionalidade, os resultados obtidos sugerem que as fêmeas púberes, independente dos grupos, são menos ansiosas que as demais fases, pois ambulam significativamente mais nas áreas aversivas de CA e LCE (GE, p>0,05 e p>0,05; GC, p<0,05 e p>0,05, respectivamente). As púberes também apresentaram comportamento de maior mobilidade no NF, quando contrastadas com outras fases de desenvolvimento (GE, p>0,05; GC, p<0,05). O contraste de emocionalidade entre grupos, no entanto, sugere que as GE não diferiram significativamente das fêmeas GC (p<0,05), para todos os testes. Para o cuidado materno, as fêmeas GE realizaram significativamente (p>0,05) menos placentofagia, e tiveram filhotes significativamente (p>0,05) com maior peso na primeira semana de vida do que as fêmeas GC. Os dados de proteção materna, avaliado pelo teste de resgate, e a construção de ninho estão sendo ainda analisados. Nos procedimentos moleculares, a concentração de DNA do tecido hipotalâmico extraído, foi de 918 a 18.540 ng. O gene selecionado foi o Bdnf (Brain‐derived neurotrophic fator), que possui primers listados na literatura, mas também será realizado o desenho de novos primers, e após a conversão do DNA por bissulfito, será verificado o padrão de metilação desse gene em GE e GC. Em linhas gerais, conclui-se que o efeito do EA foi relativamente positivo e não demonstrou ser um estressor na fase de vida em que foi aplicado, entretanto, não foram encontrados contrastes significativos entre os grupos testados. O efeito do EA na fase materna e na metilação do gene Bndf nos hipotálamos dessas fêmeas será investigado posteriormente e caso seja encontrada essa associação, visamos utilizá-lo como potencial marcador epigenético associado ao bem-estar animal.

Apresentação

ID: 9592

Resumo

Proteínas são biomoléculas responsáveis por diversas funções nas células, sendo essenciais na manutenção da homeostase celular. A TRAP-1 é uma chaperona molecular mitocondrial, responsável pela manutenção da homeostase mitocondrial [1,2,3]. A CyP-D é uma das ciclofilinas presentes em humanos, e possui um papel de co-chaperona, regulando diversos mecanismos de atividade de chaperonas além de outras proteínas [4]. Ambas, TRAP-1 e CyP-D são alvos de grande interesse [1,2,5,6,7,8], pois estão relacionadas com o fenômeno da permeabilidade transitória mitocondrial, presente em alguns cenários patológicos, e podem ser envolvidos em possíveis abordagens de combate a doenças, como o câncer. O principal objetivo desse trabalho é avaliar a interação entre as duas proteínas recombinantes humanas. Para tal, fez-se uso de técnicas de expressão heteróloga e purificação para a obtenção das proteínas, seguida pela análise por gel filtração analítica e por pulldown para avaliação da interação proteína-proteína.

A expressão heteróloga das proteínas foi realizada em E. coli, seguida pela extração por um processo de lise mecânico-enzimática e posterior purificação por cromatografia líquida. Primeiramente foi realizada uma cromatografia de afinidade por metal imobilizado [9] seguida por uma cromatografia de exclusão molecular [10]. A eficiência dos processos foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) e a determinação da concentração das proteínas puras foi realizada por medidas espectrofotométricas. Ambas as proteínas foram caracterizadas por meio do processo de gel filtração analítica e finalmente, a interação foi avaliada por pulldown [11].

A análise dos processos de obtenção das proteínas demonstra que ambas foram produzidas com sucesso. A gel filtração analítica indicou que a proteína TRAP-1 é um dímero assimétrico em solução e Cyp-D um monômero globular, dados corroborados pela literatura. O pulldown confirmou a interação física entre as proteínas em todas as condições testadas. Alguns objetivos não foram iniciados devido a suspensão das atividades diante do cenário da pandemia, mas estão listados como perspectivas futuras de continuidade desse projeto, onde se encaixam a análise da interação por gel filtração analítica, assim como as caracterizações estruturais das proteínas, individualmente e complexadas, por dicroísmo circular, fluorescência e calorimetria de titulação isotérmica. A confirmação dessa interação e futuro detalhamento de seus parâmetros moleculares  e termodinâmicos irá contribuir para o entendimento do correto funcionamento maquinaria celular. Tais informações permitirão a compreensão da atuação dessas proteínas tanto no funcionamento organelar normal, como em cenários patológicos o que,  por sua vez, abre caminho para a proposição de diferentes abordagens que visem solucionar esses desafios enfrentados pelas ciências médicas.

Apresentação